Analyse af ancientDNA

Baggrunden for analysen af ancient DNA

Indtil 80´erne var DNA-analyse begrænset til undersøgelser af moderne væv, men i 1984 lykkedes det for første gang at udvinde DNA fra forhistorisk materiale – nemlig fra et individ af den uddøde art af hestefamilien, quaggaen.

Mange entusiastiske studier af DNA fra forhistoriske dyr og mennesker fulgte efter dette. Mange viste sig dog senere at have været falsk-positive resultater.
Den øgede viden om kontamination, nedbrydning og bevaring af DNA samt publiceringen af flere artikler med kriterier, som bør overholdes for at sikre autensitet, har dog nu gjort forskningen i ancient DNA (aDNA) troværdig. I dag anvendes DNA-analyse på mange forskellige og gamle materialer og den konstante udvikling af metoden har gjort det muligt at adressere mange arkæologiske problemstillinger.

Fakta om kerne- og mitokondrie DNA

  • mtDNA findes i tusindvis af kopier i cellen, mens nuDNA kun findes i en til to kopier i hver celle

  •  mtDNA er lettere at udvinde fra forhistoriske og historiske prøver

  •  nuDNA er sværere at udvinde, men kan give flere informationer

DNA er arvematerialet i alle kendte levende organismer og koder for synlige så vel som usynlige træk hos mennesker, planter og dyr.
DNA-analyse er en genetisk metode, med hvilken sekvenser af et individs genetiske information udvindes og ”læses”.

Kerne- og mitokondrie DNA
Størstedelen af vores DNA befinder sig i cellekernen (kerneDNA eller nuDNA), mens en mindre del findes i de energiproducerende mitokondrier i cellen. Dette kaldes mitokondrie DNA eller mtDNA. nuDNA er kun til stede i en til to kopi i hver celle, mens en celle kan indeholde tusindvis af kopier af mtDNA.

På grund af den numeriske forskel mellem de to typer DNA, er det generelt lettere at udvinde mtDNA – især hvis prøvematerialet er gammelt og nedbrudt.
Ikke desto mindre indeholder nuDNA den største mængde af information om funktionelle genetiske træk. mtDNA har dog været den mest anvendte type DNA til analyser af forhistoriske prøver, da den er lettere at udvinde og en god indikator for slægtskab mellem individer og populationer.

 

Hvad kan DNA anvendes til i kulturhistorisk sammenhæng?
DNA-analyse kan anvendes til meget forskelligartede analyser af specifikke genetiske træk som fx køn, samt slægtskab i kortere eller længere perspektiv, som fx tilhørsforholdet til en art eller population (se nedenfor). Dette kan også benyttes i spørgsmål om domestikation og tilstedeværelsen af arvelige sygdomme. Ligeledes kan nærmere slægtskabsrelationer undersøges, fx blandt skeletter på en gravplads.

Bestemmelse af geografisk oprindelse med mtDNA og haplogrupper
mtDNA nedarves kun gennem den moderlige linje (se figur til venstre), og krydses derfor ikke med faderens DNA, som det er tilfældet for resten af vores DNA. Det betyder, at børn har præcis den samme mtDNA som deres mor, med mindre den muterer.
Mutationer forekommer kun sjældent, men over lang tid vil mutationerne ophobes og betyde, at mtDNA hos tæt beslægtede populationer har få forskelle (mutationer mellem sig), mens fjernere beslægtede populationer og individer har flere forskelle.
Mutationerne bruges ofte til at kortlægge populationers geografiske spredning med de såkaldte haplogrupper og –typer (se figur til højre). Med en vis sandsynlighed kan ved hjælp af disse bestemme et individs (forfædres) geografiske oprindelse, ved at undersøge hvilken population individet er tættest genetisk beslægtet med.

   

Hvilke materialer kan DNA-analyse anvendes på?
DNA-analyse kan anvendes på organisk materiale fra både moderne og forhistoriske kilder. Sådanne materialer inkluderer menneske- og dyreknogler, væv (hud, muskel og organer), tænder, hår, blod, plantedele, tekstiler, læder, sedimenter, koprolitter mm.

De følgende retningslinjer gælder for alle typer materialer. Ved prøvetagning kan der dog være enkelte forskelle, som beskrives herunder. For humant DNA træffes særlige forholdsregler, da der her er risiko for at forurene med egen DNA.

 

Optimale miljøer for bevaring af DNA er:
• Kolde
• Tørre 

Hvilke kontekster og bevaringsforhold giver de bedste resultater?

Når man arbejder med DNA fra forhistoriske prøver, afhænger analysernes succesrate i høj grad af det miljø, prøven har befundet sig i før, under og efter nedgravningen. Som udgangspunkt er våde og varme miljøer skadelige for bevarelsen af DNA, dette indbefatter også mose-kontekster, hvorfra der kun findes et enkelt eksempel på vellykket udvindelse af DNA.
Ligeledes er miljøer, hvor pH-værdier varierer væsentligt fra neutralt, skadelige for DNA.

Materialets og metodens begrænsning og usikkerhed
DNA-analyse kan kun besvare spørgsmål, der er relateret til et specifikke gener. Hvis man vil undersøge et karakteristika, må man altså først undersøge, om der findes et gen, der koder for dette karakteristika.
Ellers er en af de største udfordringer ved at arbejde med ancient DNA er dens ofte meget nedbrudte og skadede karakter. Skaderne besværliggør, om ikke umuliggør, udvindelsen af DNA.
Det er derfor ikke alle prøvematerialer, der stadig indeholder udvindbart DNA, når de udgraves eller ankommer til laboratoriet. Især ældre materialer, hvor skader er ophobet over lang tid, kan være problematiske at udvinde DNA fra.
Skaderne på DNA´et øges, hvis materialerne har været nedgravet eller opbevaret i miljøer, som yderligere nedbryder DNA-stregene (se ovenfor). Derfor bør man være kritisk overfor sit materiales tilstand, før man kaster sig ud i en destruktiv samling.
Der stilles ofte spørgsmålstegn ved DNA-analysers validitet, men såfremt man har en god og kritisk tilgang til laboratorie-arbejdet samt overholder kriterier for validitet, så bør resultaterne være autentiske.

Optimal opbevaring af prøver til DNA-analyse

Prøver opbevares mørkt og koldt, gerne i køleskab.
Hvis der er tale om længere tids opbevaring, skal det foregå i en fryser.

Risikoen ved lang tids opbevaring ved stuetemperatur er, at det organiske materiale, som måske var tilbage på udgravningstidspunktet, kan være blevet nedbrudt. Hvis prøver har været håndteret meget, kan der være forurenet mellem prøver, fra de moderne omgivelser og fra de mennesker, som har håndteret dem (hvilket dog er mest problematisk for humane prøver).

Forurening med DNA fra fx madpakken, moderne reference-prøver osv. kan hurtigt overstige den mængde af gammelt DNA, der måske var tilstede i prøven og ødelægge resultatet.

Det er derfor en god ide, at beslutte sig i felten, hvis man vil have foretaget DNA-analyser, så man kan træffe sine forholdsregler allerede her.

Prøveudtagning
Hvis der skal tages aDNA prøver under udgravningen af humant skeletmateriale anbefales det at kontakte et laboratorium specialiseret i analyse af aDNA førend udgravningen påbegyndes. De forskellige laboratorier har forskellige procedurer, men der er dog enighed om at det bedste resultat opnås ved at isolere aDNA prøven direkte under udgravningen. Følgende forholdsregler anbefales i forbindelse med udgravning og prøvetagning af aDNA prøver fra humant skeletmateriale.

  • Prøver udtages med handsker. Latex handsker kan med fordel benyttes, handskerne skiftes mellem hver prøve for at undgå konterminering. Undgå at røre dig selv eller andet ved prøvetagning - i så fald skiftes handskerne. Det kan være en fordel at bære to par handsker overnpå hinanden, hvoraf det yderste skriftes mellem prøverne. Alternativt kan gummihandsker benyttes, som inden og mellem hver prøve dekontermineres i en 5-10% klorinopløsning (kan købes som rengøringsmiddel i de fleste supermarkeder).
  • Brug mundbind til at tildække munden og sæt langt hår op.
  • Undlad at ryge
  • Undgå vask af fund! Det er den absolut mest destruktive proces for DNA!
  • Undgå at prøven kommer i kontakt med jorden efter udgravning og prøvetagning. Den kan tilføre forurende DNA.
  • Plasticbøtter med skruelåg, ziplock poser eller eppendorf-rør er ideelle til opbevaring af prøver. De skal være sterile! Dvs. ikke tidligere åbnet. Evt. kan prøves pakkes ind i staniol inden den lægges i beholderen. Ved brug af ziplock poser skal man være yderst opmærksom på, at der ikke dannes kondens, da det er et optimalt miljø for mikroorganismer, som nedbryder DNA.Læg ikke udtagne prøver på jorden, men put dem med det samme i en lufttæt beholder.
  • Benyt fx pincet, som kan stereliseres med en lighter, ved udtagning af mindre prøver fra større materialer, fx hår. Det er også muligt at købe engangspincetter.
  • Notér meget gerne jordbundsforholdene omkring prøven, herunder fx pH-værdi, tilstedeværelse af metalgenstande, tør/våd bund osv.
  • Ved udtagning af humane prøver bør man være omend endnu mere forsigtig, da man selv kan forurene prøverne. Brug handsker og mundbind. Desuden skal alle involverede DNA-testes.

Mængde af prøvemateriale
Mængden, der skal bruges til en DNA analyse, varierer fra materiale til materiale og efter metoden, der skal anvendes. Det anbefales at tale med det benyttede laboratorium om prøvestørrelserne. Her kommer dog nogle retningslinjer.

For knogle og tænder behøves 0,1 gram til en DNA-analyse. Op til 1 gram er dog optimalt, hvis flere analyser er nødvendige. Da der som oftest foretages replikationer, er to eller flere prøver fra samme materiale det optimale, gerne udtaget forskellige steder. Det kan være ideelt for knogler og tænder at sende hele knogler og tænder til laboratoriet, hvor der så kan udbores materiale under kontrollerede forhold.

For skind og hårprøver er som oftest praktisk at udtage hvor det opbevares, i disse tilfælde benyttes rene redskaber og beholdere som beskrevet ovenfor. For denne type materiale er minimum 30-50 mg. Mere er optimalt, da det kan være nødvendigt at reproducere resultaterne. Under 30 mg giver sjældent et resultat.

For plantemateriale som fx er det oftest nødvendigt at bruge hele frø og kerner, så de udvalgte objekter sendes derfor direkte til laboratoriet.

Strategier for prøveudtagning
Udtag gerne jordprøver omkring prøvematerialet og frys dem, i tilfælde af, at man i fremtiden vil gå tilbage til jordprøverne og undersøge, hvad den geokemiske sammensætning var, eller om der var konterminanter.

Opsummering:
1.  Undersøg om det er værd at foretage DNA-analyse
2.  Tag flere prøver og brug foranstaltninger mod kontamination (handsker, mundbind og evt. dragt)
3.  Opbevar korrekt
4.  Tag jordprøver

Kontakt evt. et DNA-laboratorium for råd og vejledning omkring strategi og prøvetagning.

 

Litteratur
Uddybende om DNA generelt se fx:
Brown, T. og Brown, K. 2011. Biomolecular Archaeology. An introduction. Wiley-Blackwell.

For uddybende om validitet henvises til:
Cooper, A. og Poinar, H. 2000. Ancient DNA: Do it Right or Not at all. Science 289, 1139.
Gilbert, M. T. P.; Bandelt, H.-J.; Hofreiter, M. og Bernes 2005. Assessing ancient DNA studies. TRENDS in Ecology and Evolution, Vol. 20 No. 10, 541-544.

Yderligere om bevaringsforhold, se fx: Mere i Willerslev, E.; Hansen, A. J. og Poinar, H. N. 2004. Isolation of nucleic acids and cultures from fossil ice and permafrost. TRENDS in Ecology and Evolution, Vol. 19, 141-147.

Procedurer i udtagelse af DNA er grundigt beskrevet i: ”Melchior, L., Kivisild, K., Lynnerup, N. og Dissing, J. 2008: Evidence of Authentic DNA from Danish Viking Age Skeletons Untouched by Humans for 1000 Years, I: PloS ONE 2008 3(5): e2214.